在2002年八月一篇發表在Cell的文章，題目是「Direct differentiation of embryonic stem cells into motor neurons」。作者Thomas M. Jessell是任教於紐約哥倫比亞大學的學者，他在神經科學領域相當有名，他著作的教科書「Principle of Neuroscience」幾乎是所有念神經科學的人所必須拜讀的聖經。 任何有醫療常識的人都知道神經系統在受傷之後是無法再生的，所以車禍、中風、甚至是遺傳性或者退化性的神經病變都將導致病人終身肢體傷殘，這篇文章為這些病患提供一線曙光，從胚胎幹細胞去培養出負責傳遞運動神經訊息的運動神經元，再將之植回受傷的動物脊髓相對應位置，證明這些由胚幹細胞所分化出來的運動神經元具有修復肌肉運動功能的能力。
前言
在胚胎發生的過程中，不同形態、彼此分工的體細胞（somatic cell）都遵循一定的分化途徑，而控制這些體細胞分化的路徑和決定因素等相關分子生物學研究便成為近年科學界的熱門話題，以中樞神經系統為例，完整的脊椎動物其神經系統包含幾百種不同形態與功能的神經細胞種類，其中包括引發神經傳導電位的神經元（neuron），支持這些神經細胞功能的膠細胞（glia cell）….等等，其中神經元又可以分成多種形式：負責傳遞感覺訊息的感覺神經元（sensory neuron）；負責中樞訊息整合的中介神經元（interneuron）；和負責傳替運動訊息到肌肉或線體的運動神經元（motor neuron）。在脊椎外傷或退化性神經病變的診療過程中，運動神經元的耗損往往造成病患終身行動不便的遺憾，這些傷患所消耗的醫療資源和社會成本相當可觀，也促使神經科學界對於運動神經再生的議題產生迫切的興趣與需求。過去關於神經再生的幹細胞研究範疇大致分為三大類：
（1）成體中樞神經系統（adult brain）中某些位置，如位於臨邊系統的海馬回（hippocampus）其齧齒回（dentate gyrus）可以製造出數量有限，但具有分化能力的神經先驅細胞（neuronal progenitor cell），這類細胞具有修補海馬回因老化或受損所喪失的神經細胞功能；
（2）由其他非神經系統或組織所衍生的先驅細胞（nonneuronal progenitor cell），在特定的條件下可以培養成神經細胞來進行修補神經系統的缺損，舉例來說，由小鼠的骨髓（bone marrow）得到的先驅細胞可以培養成神經元來進行神經修補；
（3）由胚幹細胞（embryonic stem cell）直接培養成神經細胞來進行神經修補，這類的研究由於胚幹細胞具有取之不盡用之不竭的生長特性，其結果特別受到科學界的重視。 研究發現，小鼠的胚幹細胞可以在特定的培養條件下被分化成表現中腦多巴胺分泌神經細胞（dopaminergic neuron）特徵的神經元 ，這些類多巴胺神經元已經被證實經神經移植可以若干程度改善小鼠在罹患巴金森式症動物模式後所出現的運動缺失。
本篇報告的內容就是在介紹如何將小鼠的胚幹細胞培養成為脊髓中的運動神經元，這些經分化後的類運動神經元不但可以表現正常運動神經元所需要的功能蛋白質（marker），經轉植手術後還可以和受傷的肌肉形成連結，分泌乙烯膽鹼（acetylcholine）來改善肢體活動的運動缺失。
神經發育學的重大發現
要將胚幹細胞分化成為脊髓中的運動神經元，科學家必須先了解在脊椎動物中樞神經發育的過程中，運動神經元受到哪些轉錄因子（transcription factor）的調控？如圖所示，胚胎中的外胚層細胞在形成神經脊（neuronal crest）後，從頭部到尾部其不同體節的位置會表現不同的轉錄因子，其中前腦（telencephalon）表現FGF8；中腦（diencephalon）向後延伸到脊髓位置其背部表現Wnt1而腹部表現 Sonic hedgehog（Shh） ；腦幹這一段因為腹部FGF4和背部BMP4的表現而和前後區塊分隔，之後，前段發育為大腦而後段因表現Retinoic Acid（RA）而發育成為脊髓 。
就脊髓的背側和腹側來看，神經發育也是有類似的分節情形，脊髓腹側的最底部之後會出現運動神經元，往上一點則是出現V2神經元，以小鼠和雞的神經胚胎發現來說明，脊髓的背側到腹側每個區塊都表現特定的轉錄因子，背側（roof plate）因為 BMP4而腹側（floor plate）因為Shh的濃度較高而產生一個對應梯度，這兩個轉錄因子不同濃度的刺激是導致脊髓背、腹側呈現不同區塊的重要因素；以之後要出現運動神經元的區塊來說，高濃度的Shh刺激homeodomain（HD）和basic helix-loop-helix（b-HLH）兩類轉錄因子的表現，其中運動神經元先趨細胞會專一性的表現Pax6與Nkx6.1兩種HD蛋白質以及Olig2這種 b-HLH蛋白質；這三種轉錄因子決定了該區域神經細胞之後發育成為運動神經元的命運。首先，先驅細胞會脫離細胞週期（cell cycle）而分化成為成熟的運動神經元 ；其次，這三種轉錄因子的下游基因HB9啟動， 它是「專一」表現在成熟運動神經元的一種HD蛋白質 。
小鼠的胚幹細胞經特定轉錄因子的刺激而分化成為運動神經元
藉助上述神經胚胎的研究發現，科學家在培養皿裡面製造類似的發育環境，嘗試將小鼠胚幹細胞培養成運動神經元。採用的步驟簡述如下：
（1）首先將胚幹細胞用aggregate culture兩天的方法先養成ES bodies ，每個ES bodies約包含1000個細胞，之後加入RA培養2~7天，加入RA培養的ES bodies中表現 Sox1（pan-neural progenitor marker） 和NeuN（post-mitotic neuron marker） 明顯多於不加入RA的ES bodies；此外，加入RA可以大幅增加表現Otx2（一種表現在中腦之後的caudal position identity marker）和Hocx6（一種spinal cord identity marker）的細胞。
（2）利用RA建立caudal identity之後，加入Shh進行ventral identity的誘導，如圖四所示，將上述ES bodies加入不同濃度的Shh合成蛋白質，配合活體小鼠脊髓神經胚胎發育的免疫染色，高濃度（1uM）的Shh誘使ES bodies大量表現出運動神經元先驅細胞所需要的轉錄調控因子Pax6、Nkx6.1和Olig2。其中20~30%的ES bodies並出現表現HB9的細胞，這些表現HB9的細胞經免疫染色證實亦表現NeuN且不會incorporate BrdU，表示這些細胞已經是post-mitotic neuron。
（3）找到適合誘導ES bodies發育成運動神經元的適當條件之後，研究者必須想辦法建立一個可以用來觀察並純化這些表現HB9的平台，因為ES bodies本身的細胞種類異質性很高，想要用流體細胞分離技術分出這些運動神經元必須藉助小鼠基因轉植工程的技術，研究者建立一隻由HB9基因啟動子（promoter）來表現EGFP的基因轉植小鼠，螢光顯色證明EGFP只表現在這小鼠脊髓的運動神經元。之後再建立這隻基因轉植小鼠的胚幹細胞株。驗證上述加入RA和Shh確實可以將ES bodies誘導表現大量表現EGFP的運動神經元，因為螢光方便觀察的關係，我們可以再圖六看到這些表現EGFP的細胞會延伸出軸突（axon）並表現製造乙烯膽鹼的重要酵素ChAT，神經衝動要興奮肌肉收縮必須分泌乙烯膽鹼，這發現顯示這些運動神經元應該具有收縮肌肉的功能。
（4）為了驗證這些由胚幹細胞分化來的運動神經元，研究者藉助流式細胞分離技術（FACS）來修正誘導ES bodies分化出運動神經元的最佳劑量，實驗發現給予2uM的RA加上1uM的Shh可以產生最多表現EGFP的運動神經元，單獨只給相同劑量的RA或Shh幾乎不能誘導出任何表現EGFP的運動神經元。
（5）純化出這些表現EGFP的運動神經元後，試圖在雞胚（stage15~17）的脊髓進行活體運動神經元的移植手術，
如圖所示，到了雞胚發育到stage 27時，觀察到所移植的小鼠運動神經元在雞胚的脊髓中建立連結，這些連結和正常的運動神經元完全相同，利用免疫染色觀察這些運動神經元的末梢，在雞胚發育到stage35時，這些表現EGFP螢光的運動神經元末梢和肋骨肌肉形成連結，表現分泌乙烯膽鹼所需的marker，如synaptobrevin（syb）和vesicular Ach transporter（VAChT），顯示這些運動神經元儘管式不同物種的胚幹細胞所誘導出來，仍然具有在活體身上引發肌肉收縮的功能。
結論
胚幹細胞的研究相當有淺力，從這篇文章的介紹，我們不難理解之後的生物醫學一定會和胚幹細胞有密切關係，然值得注意的是這些成功報告目前都還在只是實驗動物的階段，期待未來有更多活體人類的成功案例，造福更多需要幫助的病患。
日前聽了一場主題不太一樣的演講，講者是the Journal of Cell Biology (JCB)的編輯 Mike Rossner。講題是有關於科學論文中的偽造事件。
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